Métodos de observação de rotina e precauções de cultura de células
Métodos de observação de rotina e precauções de cultura de células
Após as células serem inoculadas ou subcultivadas, o experimentador deve fazer exames de rotina das células todos os dias ou no máximo 1 a 2 dias. Observar a morfologia e crescimento das células, assim como a mudança de pH da cultura, se há poluição, etc. De acordo com as mudanças dinâmicas das células, faça reposição de fluidos ou tratamento de passagem. Se forem encontradas condições anormais, tome medidas a tempo.
1. Células com bom estado de crescimento morfológico podem ser vistas ao microscópio geral, com grande transparência, forte refração e contorno pouco claro. Quando as células crescem mal, o contorno é realçado, vacúolos, gotículas lipídicas e outras partículas muitas vezes aparecem no citoplasma, o espaço entre as células é aumentado e a morfologia celular é irregular ou até perde suas características originais, como células epiteliais tornam-se epiteliais como células. Quando as células morrem, alguns corantes podem se combinar com o DNA nuclear desintegrado através da membrana celular desnaturada e torná-las coloridas. Portanto, o azul de tripano é frequentemente usado para identificar células vivas e mortas. As células vivas não se coram e os núcleos mortos são azuis.
2. Crescimento celular após cultura primária ou inoculação de suspensão de células subcultivadas, começou a proliferar após diferentes períodos de incubação. Linhas celulares de passagem, tecidos embrionários ou tecidos larvais geralmente observam o crescimento celular no dia seguinte e podem ser conectados em pedaços dentro de uma semana. Depois que as células inoculadas crescerem por toda a parede do frasco, elas devem ser recultivadas a tempo. Caso contrário, devido ao consumo de nutrientes e acúmulo metabólico, as células entrarão no período de parada ou degradação. Nesse momento, o contorno celular é aprimorado e depósitos granulares geralmente aparecem nas células, que são mitocôndrias inchadas. O citoplasma é vacuolizado e as células tornam-se redondas e ásperas. Em casos graves, as células caem da parede da garrafa. Somente subcultivando no tempo as células podem continuar a crescer e se reproduzir.
3. Em condições normais, a solução nutritiva é vermelho pêssego. Se as células forem mantidas em pH 6,5 ~ 6,6, as células cairão e morrerão. Quando o meio de cultura é acidificado e fica amarelo, indica que os metabólitos no meio de cultura se acumularam até uma certa quantidade, e o meio de cultura fresco precisa ser substituído. Se HEPES for adicionado ao meio de cultura ou cultivado em uma incubadora de 5% de CO2, o pH pode ser mantido relativamente estável. O tempo de mudança da solução nutritiva depende do consumo de nutrientes. Quando a célula cresce vigorosamente, ela pode ser trocada a cada 2 ~ 3 dias, e quando o crescimento é lento, ela também pode ser trocada a cada 3 ~ 4 dias. Atenção especial deve ser dada ao fato de que várias células têm diferentes requisitos para o valor de pH.
4. Contaminação microbiana após a contaminação microbiana da cultura de células cultivadas, o valor do pH mudará e o meio de cultura parecerá turvo. Após a infecção bacteriana, devido ao movimento das bactérias, há um leve flash sob o microscópio de luz; Na infecção fúngica, muitas hifas filamentosas e, às vezes, esporos agrupados foram vistos ao microscópio; A contaminação por micoplasma só pode ser detectada com a ajuda de alguns métodos de detecção. Após a contaminação da célula, geralmente deve ser descartada. Para linhas celulares importantes, você pode consultar monografias relevantes para introduzir algumas medidas para remover a poluição. Experimentos importantes e células preciosas devem ser cultivados e operados por pelo menos dois experimentadores independentemente, ou por uma pessoa em várias vezes (em momentos diferentes). Além das condições sanitárias do laboratório de cultura, a umidade do ar está intimamente relacionada à poluição microbiana. Experimentos importantes e de longo prazo devem ser realizados no outono e inverno, quando a umidade do ar é baixa.
Outras precauções:
Primeiro, observe frequentemente para determinar o estado da célula.
Em segundo lugar, se adicionar antibióticos. Isso depende da situação. No processo de cultura de células, é necessário adicionar o mínimo possível de impurezas irrelevantes. Os antibióticos também são um fardo para as células.
Terceiro, o descongelamento do soro fetal bovino. O soro geralmente é armazenado a - 20 ℃ e descongelado na geladeira a 4 ℃, o que leva muito tempo e precisa ser descongelado com um dia de antecedência.